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超声波破碎细胞的常见问题

发布时间:2010-01-19   点击次数:3055次
大肠杆菌表达外源蛋白,在超声破碎的时候,用含有1%triton-X-100的PBS悬浮,然后超声的效果较

好,1%triton-X-100的作用还是很明显的,对其他的一些细菌同样起作用,比如链霉菌。

    细菌沉淀直接加样品1buffer,再加5ul的巯基乙醇,混匀,离心,煮沸10min,直接上样,染色脱色步

骤如下:将胶放入适量的染色液微波炉里加热1min(下次适当补点醋酸即可),将染色液换成大量的水(自来水即

可)在微波炉煮10min 就可以。

    在表达重组蛋白后超声波破碎细胞,采用冰浴,400w,破2s停1s,但是不一会就产生大量泡沫,影响
 
了破碎功率,pbs和tris缓冲液都是这样,zui后都是破碎不完全,而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。
 
1*会产生气泡是因为你的探头位置没放好。探头一定要接近底部,约1cm(我一般是距底部0.5mm)。功
 
率根据仪器不同会有所不同,但你可以观察液面,有波动但不要太剧烈就好。
 
2*破3S停10S,破个二三十次看看。

3*变幅杆位置摆放也要注意,听声音如果不对的话就要及时调整。另外可以从菌浓度方面考虑。 在破碎时
 
试着加大体积,强度zui好不要超过60%.
 
4*尝试超8s停8s,对有些菌体蛋白来说,你的方法很难散热,导致蛋白变性产生气泡,zui好停顿时间稍长一
 
些,这种情况多见于包涵体形式的蛋白。

链霉菌(放线菌)超声破碎的,用的方法条件是什么?
 
前处理一般就是配置成一定浓度的菌悬液。

使用超声破碎时采用的具体条件是:

(1)取细菌的24 h培养液于5 000 r/min 下离心5 min收集菌体.
 
(2)用pH 7.5的Na2HPO -NaH2PO 缓冲液洗涤3次,再用该缓冲液将菌体配成1:3的菌悬液.置于40
 
mL大塑料试管内.
 
(3)将大塑料试管置于冰浴中,采用超声波破碎(功率200 W,1/2”探头,破碎30 s,间歇30 S).
 
(4)破碎液于12 000 r/min下高速冷冻离心30 min,收集细胞碎片和上清夜.

 
    超声破菌流程与 上述基本一致,就是洗涤菌体也可以用预冷的生理盐水或pH8的Tris-HCl,洗涤一次就
 
可以。另外,超声剂量随样品量、菌体改变比较大,功率可以到400-600w,超5s,停5s,冰浴,要加终
 
浓度1 mM的PMSF。为确定合适的超声强度和次数,有必要随时镜检观察菌体是否完全破碎。
 
    放线菌属于原核生物系统进化树上的(G+C)摩尔百分含量(mol%)高的革兰氏阳性菌
 
(Eubacteria)分枝类群,它虽然具有原核生物特有的分子生物学特性,但在其不同类群中,细胞壁的化学
 
组分变化很大。

    在做大肠杆菌超声时,采用的是400W,超5停5的方法,效果不错,但是用在链霉菌上,似乎没什么效
 
果。会不会就是由于细胞壁组成差异造成的呢,因为大肠杆菌式属于革兰氏阴性菌的。

    再有镜检是检验破碎效果,但是细胞破碎程度和我需要的酶获得之间有正比关系吗?破碎时间长也会影响到
 
酶的活性。所以想问问anaisai战友,你提供的“功率200 W,1/2”探头,破碎30 s,间歇30 S”的条
 
件好像是用于破碎链霉菌孢子的,也可以用于发酵离心后的菌泥吗?如果可以,你破碎的全程时间大概是多
 
少呢? 

    如果你需要的是胞内酶,细胞破碎程度和需要的酶获得之间基本上有正比关系。破碎时间长的确会影响到
 
酶的活性。这就需要在zui佳的破碎时间和酶活性之间做出判断,zui直接的办法是先绘制相关曲线(酶活性和
 
时间的关系曲线)。

    实验中,破碎的是棒状杆菌(也是很难破壁的G+菌),破碎时间控制在30min左右,酶活较好。

 
如果是基质菌丝的话,好可以考虑用溶菌酶处理一下.

一般来讲这几种方法读可以的:
 
一,液氮研磨
 
二,用french press破碎
 
三,超声波破碎
四,溶菌酶处理预处理

    超声波是物质介质中的一种弹性机械波,它既是一种波动形式,又是一种能量形式。超声对细胞的作用主要
 
有热效应,空化效应和机械效应。热效应是当超声在介质中传播时,摩擦力阻碍了由超声引起的分子震动,
 
使部分能量转化为局部高热(42-43℃)。空化效应是在超声照射下,生物体内形成空泡,随着空泡震动和
 
其猛烈的聚爆而产生出机械剪切压力和动荡。另外,空化泡破裂时产生瞬时高温(约5000℃)、高压(可达
 
500×104Pa),可使水蒸气热解离产生.OH自由基和.H原子,由.OH自由基和.H原子引起的氧化还原反应
 
可导致多聚物降解、酶失活、脂质过氧化和细胞杀伤。机械效应是超声的原发效应,超声波在传播过程中介
 
质质点交替地压缩与伸张构成了压力变化,引起细胞结构损伤。损伤作用的强弱与超声的频率和强度密切相
 
关。

 
 
拌,发现菌液发粘,菌体不能够很好分散,用高压匀质机破碎,加压后,菌液不能进入匀质机,速度很慢,
 
请问是何原因?能有好的办法解决,很好用匀质机快速破碎菌体?
 
将破碎液的量加大,不能很好分散可能是量太大 。超声处理5-10分钟,菌液粘度即可大大降低,也可促进
 
菌体分散。

    不同型号的设备功率不一样,功率的大小决定了使用变幅杆的大小范围(直径2mm至几十毫米),你使

用多大的变幅杆就在设备的上调至该刻度(很简单的)!变幅杆的大小决定了处理量5ml一下选3mm,5~

50ml可选6~8mm,50ml以上选10mm的变幅杆,依此类推!占空比不用关心的,主要是指超声时间和停

顿时间的比值。

酵母破碎的问题

    一般的PROTOCOL都是用glass beads  破碎酵母细胞sigma G-8772 酵母破碎效果好的我所做过的方
 
法中还是玻璃珠,效率很高,而且对目的蛋白活性不会有什么影响。一般应该用这个方法。

     化学裂解的方法,10g酵母 加1ml的乙酸乙酯,充分搅拌至液体状。此法的裂解效果不错的
 
加尿素裂解液(尿素8mol/L, NaCl 0。5mol/L,Tris 20mmol/L, EDTA 20mmol/L, 2%SDS, PH值
 
8。0),据说效果可以。
 
毕氏酵母细胞破碎法
 
    在破碎遇到的问题是菌体浓度太低,OD620nm在4-6之间。细胞破碎仪的zui低破碎体积为4ml左右,这
 
样再稀释一倍,OD就到2-3啦,我们怀疑破碎完溶出蛋白和酶活测定时会测不准。所以请教大家细胞破碎时
 
zui低的菌浓多少为下限?我们的菌是一种棒杆菌。 破碎后,你可将液体放入透析袋中浓缩。
 
    我们所做的方法是按照1:20的比例将离心后的菌体(e。coli)溶解于超声缓冲液(50mM 磷酸 pH
 
8。0 )300w 10s/10s 破碎20分钟。做了镜检!基本全被破碎了!我做蛋白纯化的,做的包涵体。实验中
 
我们的菌体浓度相对独立,与培养液中的菌体od无关,不收其限制,便于操作者调控。
 
一般按每g湿菌体加5-10ml裂菌缓冲液。
 
超声肯定会产热,所以一定要有降温装置,除非你需要得成分耐高温。
    100g大肠杆菌溶于1L破碎液里(破碎掖:50mM Tris-Cl(PH8.5) 5mM EDTA 0.14M NaCl),搅
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